无血清培养基（用于制备单克隆抗体等的培养基）

基本介绍

无血清培养基是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。

无血清培养基的基本配方：基本成分为基础培养基及添加组分两大部分。用于生物制药和疫苗生产的细胞在体外培养时，多数呈贴壁生长或兼性贴壁生长；而当其在无血清、无蛋白培养基中生长时，由于缺乏血清中的各种粘附贴壁因子如纤粘连蛋白、层粘连蛋白、胶原、玻表粘连蛋白，细胞往往以悬浮形式生长。

组分简介

1.促贴壁物质：许多细胞必须贴壁才能生长，这种情况下无血清培养基中一定要添加促贴壁和扩展因子，一般为细胞外基质，如纤连蛋白、层粘连蛋白等。它们还是重要的分裂素以及维持正常细胞功能的分化因子，对许多细胞的繁殖和分化，起着重要作用。纤连蛋白主要促进来自中胚层细胞的贴壁与分化，这些细胞包括成纤维细胞、肉瘤细胞、粒细胞、肾上皮细胞、肾上腺皮质细胞、CHO细胞、成肌细胞等。

2.促生长因子及激素：针对不同细胞添加不同的生长因子。激素也是刺激细胞生长、维持细胞功能的重要物质，有些激素是许多细胞必不可少的，如胰岛素。

3.酶抑制剂：培养贴壁生长的细胞，需要用胰酶消化传代，在无血清培养基中必不可少须含酶抑制剂，以终止酶的消化作用，达到保护细胞的目的。最常用的是大豆胰酶；抑制剂。

4.结合蛋白和转运蛋白：常见如转铁蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加比较大，可增加培养基的粘度，保护细胞免受机械损伤。许多旋转式培养的无血清培养基都含有牛血清白蛋白。

5.微量元素：硒是最常见的。

使用方法

目前，血清仍是动物细胞培养中最基本的的添加物，尤其是在原代培养或者细胞生长状况不良时，常常会先使用有血清的培养液进行培养，待细胞生长旺盛以后，再换成无血清培养液。细胞转入无血清培养基培养要有一个适应过程，一般要逐步降低血清浓度，从10%减少到5%，3%，1%，直至无血清培养。在降低过程中要注意观察细胞形态是否发生变化，是否有部分细胞死亡，存活细胞是否还保持原有的功能和生物学特性等。在实验后这些细胞一般不再继续保留，很少有细胞能够长期培养于无血清培养基而不发生改变的。细胞转入无血清培养之前，要留有种子细胞，种子细胞按常规培养于含血清的培养基中，以保证细胞的特性不发生变化。

为了使细胞适应无血清培养，关键的是使所培养细胞：

1.处于对数生长中期

2.>90% 活细胞率

3.适应时以较高的起始细胞接种

细胞适应无血清培养基的方法

1.直接适应——细胞从添加血清的培养基转换到无血清培养基（SFM）中。

一些类型细胞可直接从包含血清的培养基适应无血清培养基。对于直接适应，接种细胞密度应该:2.5×10~3.5×10细胞/ml。当细胞密度达到1×10~3×10细胞/ml时，传代培养细胞。当细胞密度在培养4到7天后达到2×10~4×10细胞/ml时，细胞完全适应了无血清培养基。每隔3~5天，当细胞密度达到1×10~3×10细胞/ml，细胞活率在90%时，贮备的适应了无血清培养基的细胞培养物应该再次传代培养。

2.连续适应——分好几步把细胞从添加血清的培养基转换到无血清培养基（SFM）中，与直接适应相比较，连续适应趋向对于细胞更加温和一些。

（1）以2倍正常接种密度接种生长活跃的细胞培养物到75%有血清培养基：25%SFM 混合培养基中，传代培养。

（2）当细胞密度>5×10细胞/ml时，以2×10到3×10细胞/ml细胞密度，在有血清培养基：SFM为50∶50的混合培养基中传代培养。

（3）以2×10到3×10细胞/ml细胞密度，25%有血清培养基和75% SFM中传代培养。

（4）当细胞密度达到1×10到3×10细胞/ml（接种后4到6天），在100%SFM培养基中传代培养。

（5）每隔3到5天，当细胞密度达到1×10到3×10细胞/ml，细胞活率在90%时，贮备的适应了无血清培养基的细胞培养物应该再次传代培养。

建议备份前一次混合培养的培养物，直到每一次细胞适应了新的混合培养基。每一次减少血清前，可能需要在SFM/有血清混合培养基中进行几次传代。

在适应过程中，最好不要让细胞生长过度。这将增加选择亚群的可能性。需要注意，与有血清培养基相比，大部分SFM包含非常少的蛋白质，因而更易于受外界因素的影响。

细胞培养适应替代血清：许多细胞利用连续适应方法能很好的适应，用包含FBS的的培养基和包含有替代血清的培养基1∶1（v∶v）的混合培养基培养细胞。通过下列的混合培养基的方式，连续几代减少当前培养基的量：1∶2，1∶4，1∶16和100%替代培养基。每次适应改变血清比例时，传代细胞2到3次。

培养可以直接从FBS转换到替代血清。一开始就使用相同于FBS的浓度的替代物或血清，生长的延迟可能会发生，4允许进行2到3次的传代，使生长率恢复到以前的水平。

特别需要强调的是：配制无血清培养液必须使用高质量的水，如石英玻璃蒸馏器经三次蒸馏或超纯水净化装置制备的水。因为无血清培养基缺乏了血清中天然成分中和毒素、保护细胞的大分子，既便水中的有毒物质含量甚微，也可能对细胞产生致死性损害。这是无血清培养能否成功的关键因素之一。

主要优缺点

1.可避免血清批次间的质量变动，提高细胞培养和实验结果的重复性。

2.避免血清对细胞的毒性作用和血清源性污染。

3.避免血清组分对实验研究的影响。

4.有利于体外培养细胞的分化。

5.可提高产品的表达水平并使细胞产品易于纯化。

缺点：

1.细胞在无血清培养基中易受某些机械因素和化学因素的影响，培养基的保存和应用不如传统的合成培养基方便。

2.成本较高。

3.针对性很强，一种无血清培养基仅适合某一类细胞的培养。

培养细胞配方

1.神经细胞，干细胞，PC12细胞

成份 终浓度

葡萄糖－－0.6%

谷氨酰胺－2mM

NaHCO3－－3mM

Hepes －－5mM

胰岛素－－2.5μg/ml

转铁蛋白 －100ng/ml

孕 酮 －－20nM

丁二胺－－60μM

硒酸钠－－30nM

青霉素－－50mg/ml

链霉素－－50mg/ml

最后用DF12添加到100ml即可

2.各类小鼠胚胎癌细胞系培养基

DMEM/F12 1:1混合成1000ml

NaHCO2.4g

HEPES(1.5M) 10.0ul

硒酸（5*10-6M) 10.0ug

纤粘连蛋白 1ug/cm(37度作用15－30分钟）

胰岛素 1000.0ug

转铁蛋白 5000.0ug

3.NIH3T3小鼠成纤维细胞培养基

DMEM/F12 1:1混合成1000ml

HEPES 15mM

大豆胰酶抑制剂 0.1%

胰岛素 10.0ug/ml

转铁蛋白 25.0ug/ml

纤粘连蛋白 5.0ug/ml

4.杂交瘤细胞培养基

DMEM/F12 1:1混合成1000ml

NaHCO1.2g/L

HEPES 15mM

胰岛素 5.0ug/ml

氨基乙醇 20.0uM

硒酸 2.5mM

转铁蛋白 35.5ug/ml

应用：无血清培养基和试剂被广泛的应用于培养哺乳动物和无脊动物细胞以制备单克隆抗体，病毒抗原和重组蛋白等。大多数的无血清产品含有向细胞内转运离子的转铁蛋白和调节葡萄糖摄取量的胰岛素，以及一些蛋白质如清蛋白，纤连蛋白，胎球蛋白等，这些蛋白在细胞培养中发挥各种不同功能，如吸附毒性化合物，抗生物反应器剪切力，提供细胞贴壁所需的基质，作为脂类和其他生长因子的载体等。

种类分类

LONZA公司 无血清培养基

12-725F UltraCULTURE MEDIUM(Serum-free general purpose medium) 500ml

产品简介：一种通用的无血清培养剂

适用范围：培养贴壁和悬浮哺乳动物细胞，疫苗生产中病毒颗粒的制备

产品：

77232 PC-1Complete Serum-free Medium 500ml

77230 PC-1 Complete Serum-free Medium(powder plus supplement) 10L

344022 PC-1 Supplement (50) 10ml

产品简介：是一种低蛋白，无血清培养基。PC-1培养基旨在应用于各种研究和工业用途，使用限定成份配制的培养基确保在维持最低蛋白成分同时使细胞获得最佳的生长状态。

适用范围：培养原代细胞和贴壁依赖性细胞

产品：

12-743F UltraMEM Reduced Serum Medium

(Low-protein medium containing L-glutamine &ITES) 500ml

12-745F UltraMEM Reduced Serum Medium

(Protein-free basal medium without L-glutamine) 500ml

产品简介：用于支持多种贴壁信赖性细胞在低血清浓度下的正常生长的限定培养基。

适用范围：培养贴壁信赖性细胞

产品：

12-724Q UltraCHO Meidum(1*liquid with L-glutamine) 1L

12-715F UltraCHO Meidum(1*liquid without nucleosides) 500mL

17-811A UltraCHO Supplement(Non-sterile) 100ml

产品简介：培养基最适于培养转染和未转染的中国仓鼠卵巢细胞（CHO）细胞，表达重组蛋白质。

适用范围：培养CHO细胞; 重组蛋白的合成。

产品：12-749Q UltraMDCK Meida 1L

产品简介：是一种无血清限定培养剂，适于高/低平板密度培养MADIN-DABBY犬肾细胞（MDCK）

适用范围：培养供体外诊断（IVD）用的MDCK细胞

产品：

12-764Q PRO 293A-CDM 1L

12-765Q PRO 293S-CDM 1L

产品简介：用于293细胞（转化的人胚肾细胞）培养Pro293限定培养基系统是专为促进293细胞重组蛋白的合成和下游反应而开发的。这些配方不需要任何动物来源的成分即可支持高密度的培养

适用范围：293细胞重组蛋白和合成

产品：12-730Q Insect-XPRESS Medium 1L

产品简介：采用一种无蛋白配方，适合培养来源于Spodoptera frugiperda(Sf9和Sf21)的昆虫细胞系。

适用范围：杆状病毒的增殖，重组蛋白的表达。

产品：77203 HL-1 Complete Serum-free Medium(powder) 10L

产品简介：HL-1TM完全无血清培养基是一种限定培养基，蛋白含量低于30ug/ml. HL-1TM完全无血清培养基不含牛血清白蛋白和其它不明蛋白混合物。

适用范围：杂交瘤细胞和淋巴细胞来源的分化细胞的无血清培养。

产品：12-723 BUltraDOMA Medium 500ml

产品简介：适用于中空纤维反应器中进行中，鼠和嵌合杂交瘤细胞的培养及上述细胞的批量培养。

适用范围：杂交瘤细胞的培养，单克隆抗体的制备。

产品：12-727F FUltraDOMA-P.F.Protein-free Medium 500ml

08-024B Ultra DOMA-P.F.Protein-free Medium 10L

产品简介：一种不含蛋白的培养基，适于鼠，人和嵌合细胞来源的杂交瘤细胞系的培养。

适用范围：杂交瘤细胞和骨髓瘤细胞的培养，单克隆抗体的制备。

XVIVO系利产品

产品：

04-380Q X-VIVO 10 with Gentamicin and Phenol Red, 1 L

04-743Q X-VIVO 10 w/o Gentamicin and Phenol Red, 1 L

产品简介：为了有助于在无血清环境中制备淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)而设计的。

产品：

04-418Q X-VIVO 15 with Gentamicin and Phenol Red, 1 L

04-744Q X-VIVO 15 w/o Gentamicin or Phenol Red, 1 L

产品简介：在组成上和X-VIVO 10相似，并且经过调整优化使之适合于无血清条件下肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的增殖，其配方有助于外周学及人类肿瘤中分离纯化的CD3+细胞的增殖。同时还用于维持人类单核细胞、巨噬细胞及细胞系、粒细胞和自然杀伤细胞（NK）的生长。

产品：04-448Q X-VIVO 20 with Gentamicin and Phenol Red, 1 L

产品简介：经过改进和优化有助于单核细胞耗竭的高密度的外周淋巴细胞制备LAK细胞。

价格：待定

存储条件：2℃-8℃

三种培养的部分细胞类型应用如下：

人和鼠淋巴因子激活杀伤细胞（LAK）；外周血淋巴细胞（PBL）；人和鼠肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）；人T细胞；人和鼠巨噬细胞；人和鼠造血干细胞（克隆形成和增殖）；人体组织的冰冻保存。

X-VIVO 产品的其他应用包括：

PBL的增殖；TIL的增殖；器官的冰冻保存和移植；人单核细胞和巨噬细胞的培养；干细胞的培养；树突状细胞的培养。