基本介绍

先将生物素标记的抗体同时温育。洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用。产生颜色。颜色的深浅和样品中的浓度呈比例关系。

操作步骤

1. 配制琼脂糖EB凝胶，电泳以分离DNA片段。任何类型或等级的琼脂糖都可以使用。

我们强烈的推荐使用新鲜的TAE/TBE电泳缓冲液。不要重复使用电泳缓冲液，旧的电泳缓冲液PH会增加而降低DNA的回收产量；

2. 电泳足够时间后，在紫外灯下小心地把所需的DNA的片段切下来。并尽量去除多余的凝胶。

注意：DNA在紫外灯下的曝光的时间不要超过30秒，同时在紫外灯下操作的时候一定要戴保护眼镜。

3. 称取空离心管的重量，切下带目的片段的凝胶装在1.5ml离心管中并称其重量，求出凝胶块的重量，近似地确定其体积。一般情况下，凝胶的密度为1g/ml，于是凝胶的体积与重量的关系可按下面换算：凝胶薄片的重量为0.2g 则其体积为0.2ml；加入等倍凝胶体积的Binding Buffer，把混合物置于55℃~65℃水浴中温浴7min至凝胶完全融化，其间每隔2-3分钟混匀一次；

重要提醒：在凝胶完全溶解之后，注意凝胶-Binding Buffer混合物的pH值。如果其pH值大于8的话，DNA的产量将大大减少。观察混合物的颜色，如果是橙色或红色，则要加入5μl 浓度为5 M，pH为5.2的醋酸钠，以调低其pH值。经过这一调节，该混合物的颜色将恢复为正常的浅黄色。一般情况下，使用新鲜的电泳缓冲液，凝胶－Binding buffer混合物的PH值的不会升高；

4. 转移700μl的DNA-琼脂糖溶液到一个HiBindTM DNA柱子，并把柱子装在一个干净的2ml收集管内，室温下，10,000×g离心1min，弃去液体。

一个HiBind DNA柱子最多可容纳700μl的溶液，如果DNA-琼脂糖混合物的体积大于700μl，可先转移700μl溶液至柱子，离心完后，将余下的溶液继续加上柱子上。但是每一个HiBindTM柱子最多可以结合25~30μg DNA。如果预期产量较大，则把样品分别加到合适数目的柱中。

5. 将柱子重新套回收集管中，加300μl Binding Buffer至HiBind DNA 柱子中；室温下，10,000×g离心 1分钟，去弃滤出液；这一步相当关键，不要忽略此步。

6. 将柱子重新套回收集管中，加入700μl SPW Wash buffer至HiBind DNA柱子中，室温下，10,000×g离心1分钟，去弃滤出液；注：SPW Wash buffer在使用前必须按瓶子标鉴要求用无水乙醇进行稀释。

7. 将柱子重新套回收集管中，重复加入700μl SPW Wash buffer至HiBind DNA柱子中，室温下，10,000×g离心1分钟，去弃滤出液；

8. 弃去液体，将空柱子重新套回收集管中，10,000×g离心1min以甩干柱基质残余的液体。

这步可以去除柱子基质上残余的乙醇，不要省略此步―――对得到好的DNA产量是十分重要的。

9. 把柱子装在一个干净的1.5ml离心管上，加入30~50μl洗脱液或灭菌水上柱子膜上，10,000×g离心1分钟，离心管中的溶液就是纯化的DNA产物，保存于-20度。

如果再洗脱一次的话可以把残余的DNA洗脱出来，不过那样的浓度就会较低。

DNA的产量及质量：

把纯化产物的样品稀释一定的倍数后，分别在260nm和280nm下测其光吸收值，回收得到的DNA的浓度可按以下公式来计算： DNA浓度=光吸收260×50×稀释倍数μg/ml

长度大于500bp的片段通常能纯化得到80%的产量。而50bp~500bp的带则可达到55%~80%的回收率。(光吸收260/光吸收280)的比率是核酸纯度的一个标记。如果此值1.8，则意味着核酸的纯度>90%。另一方面，如果纯化产物的产量较低时，可以用琼脂糖EB电泳估算产物的浓度。