非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（用于酶鉴定、提纯等的实验）

实验原理

聚丙烯酰胺凝胶电泳

非变性聚丙烯酰胺凝胶和变性SDS-PAGE电泳在操作上基本上是相同的，只是非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制和电泳缓冲液中不能含有变性剂如SDS等。一般蛋白进行非变性凝胶电泳要先分清是碱性还是酸性蛋白。分离碱性蛋白时候，要利用低pH凝胶系统，分离酸性蛋白时候，要利用高pH凝胶系统。酸性蛋白通常在非变性凝胶电泳中采用的pH是8.8的缓冲系统，蛋白会带负电荷，蛋白会向阳极移动；而碱性蛋白通常电泳是在微酸性环境下进行，蛋白带正电荷，这时候需要将阴极和阳极倒置才可以电泳分离碱性蛋白。

实验器材与试剂

1、电泳仪、电泳槽、离心机等

2、丙烯酰胺、Tris、HCl、溴酚蓝、ABTS等

实验步骤

1、PAGE胶电泳缓冲液配置

1）丙烯酰胺单体贮液：14.55g丙烯酰胺加上0.45g N，N'-甲叉双丙烯酰胺，先用40mL双蒸水搅拌溶解，直到溶液变成透明，再用双蒸水稀至50mL，过滤。用棕色瓶4°C保存备用。

2)浓缩胶缓冲液贮液(0.5mol/L Tris-HCl，pH6.8)：3.03gTris溶解在40mL双蒸水中，用4mol/L盐酸调pH6.8。再用双蒸水稀至50mL。保存在4°C备用。

3)分离胶缓冲液贮液(1.5mol/L Tris-HCl，pH8.9)：18.16gTris溶解在80mL双蒸水中，用4mol/L盐酸调pH8.9。再用双蒸水稀至100mL，保存在4°C备用。

4)10%（AP）过硫酸铵：0.1g过硫酸铵溶入1.0mL双蒸水，使用前新鲜配制。

5)电极缓冲液(0.025mol/L Tris，0.2mol/L甘氨酸，pH8.3)：15.14gTris加上72.07g甘氨酸，用双蒸水稀释到5L。可在室温保存一个月。

6）样品缓冲液（0.1mol/L Tris-HCl，pH6.8）：2ml浓缩胶缓冲液贮液加上1mL87%甘油、0.1mg溴酚蓝，用双蒸水稀释至10mL，可在-20°C保存6个月。

2、Native-PAGE配方

3、Native-PAGE电泳

将玻璃板、胶垫、梳子用双蒸水洗干净，用酒精棉球擦拭，将电泳槽安装好，配制分离胶(12%)和浓缩胶(5%)如表1。过硫酸铵和TEMED最后加入，加入后聚合即开始，应立即混匀倒入两块玻璃板之间。分离胶倒入两块玻璃板间，应该留下适合的高度，使点样孔前端离分离胶有2.5cm左右的距离，在胶顶部缓缓加入约0.5cm高的双蒸水，待分离胶聚合完全后，倾去上层的双蒸水，用双蒸水清洗凝胶顶层，用吸水纸吸去残余的水滴。将浓缩胶倒入玻璃板夹层，插上梳子，待浓缩胶聚合完全后，拔去梳子，立即用双蒸水清洗点样孔。加入电极缓冲液，将样品用微量进样器点入点样孔底部，200伏电泳。当溴酚蓝到达分离胶时，电压改为250伏，继续电泳至溴酚蓝到达凝胶底部。将凝胶剥下，浸泡在100ml的底物液中，染色1小时，待胶带显色后立即照相。然后将凝胶进行常规的考马斯亮蓝染色。

结果与分析

记录和观察电泳过程中的温度变化，电泳完后进行活性染色时凝胶有色条带的变化。对比活性染色和常规的考马斯亮蓝染色后凝胶中蛋白质条带的变化。

注意事项

1. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的过程中，蛋白质的迁移率不仅和蛋白质的等电点有关，还和蛋白质的分子量以及分子形状有关，其中蛋白质的等电点是最重要的影响因子，要根据蛋白质的等电点来选择对应的电泳缓冲系统；

2. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的过程中，要注意电压过高引起发热而导致蛋白质变性，所以最好在电泳槽外面放置冰块以降低温度；

3. 蛋白质的分子量较大，则电泳时间可以适当延长，以使目的蛋白质有足够的迁移率和其它的蛋白质分开，反之亦然;

4. 变性样品的离子强度不能太高（I<0.1mM）。上样buffer中没有SDS之外，加入样品后不能加热。