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结核分枝杆菌
引起结核病的病原菌
研究历史
结核分枝杆菌
结核杆菌抗酸染色阳性(红色）
结核分枝杆菌（M. tuberculosis）简称为结核杆菌（tubercle bacilli）。早在1882年，德国细菌学家柯赫（Robert Koch，1843-1910）就已证明结核分枝杆菌是结核病的病原菌。本菌可侵犯全身各组织器官，但以肺部感染最多见。随着抗结核药物的不断发展和卫生生活状况的改善，结核的发病率和死亡率曾一度大幅下降。20世纪80年代后，由于艾滋病和结核分枝杆菌耐药菌株的出现、免疫抑制剂的应用、吸毒、贫困及人口流动等因素，全球范围内结核病的疫情骤然恶化。据WHO统计，全世界约每3个人中就有1个人感染了结核分枝杆菌，在某些发展中国家成人中结核分枝杆菌携带率高达80%，其中约5%～10%携带者可发展为活动性结核病。近二十年 由于艾滋病的流行，感染了HIV的结核分枝杆菌携带者，由于病毒破坏了机体的免疫功能，发展为活动性结核病的可能性比未感染HIV者高30～50倍，且结核的病程发展更快。此外，在HIV感染的发展进程中，结核是最早发生的一种机会性感染，结核病加重了HIV感染者或艾滋病人的疾病负担，使其更易死亡。21世纪以来全球每年约出现8百万结核新病例，并导致约3百万人死亡。中国每年死于结核病的人约25万之多，是各类传染病死亡人数总和的两倍多。因此，结核病又成为了威胁人类健康的全球性卫生问题，并成为某些发展中国家和地区，特别是艾滋病高发区人群的首要死因。
生物学性状
形态与染色
结核分枝杆菌为细长略带弯曲的杆菌，大小1～4X0.4μm。牛分枝杆菌则比较粗短。分枝杆菌属的细菌细胞壁脂质含量较高，约占干重的60%，特别是有大量分枝菌酸（mycolic acid）包围在肽聚糖层的外面，可影响染料的穿入。分枝杆菌一般用齐尼（Ziehl- Neelsen）抗酸染色法，以5% 石炭酸复红加温染色后可以染上，但用3%盐酸乙醇不易脱色。若再加用美蓝复染，则分枝杆菌呈红色，而其他细菌和背景中的物质为蓝色。本菌无芽孢、无鞭毛。
培养特性
专性需氧。最适温度为37℃，低于30℃不生长。结核分枝杆菌细胞壁的脂质含量较高，影响营养物质的吸收，故生长缓慢。在一般培养基中每分裂1代需时18～24小时，营养丰富时只需5小时。
抵抗力
扫描电子显微镜下的结核杆菌
变异性
结核分枝杆菌
懒惰性
结核杆菌生长缓慢，无运动能力，性情懒惰，其最快分裂增殖速度为18小时一代，而大多数细菌都是几分钟或几十分钟便繁殖一代，如大肠杆菌约需20分钟便可繁殖一代，10小时后，一个大肠杆菌繁殖10亿个以上，可是一个结核杆菌18个小时才繁殖2个。可别小看或轻视结核杆菌带有这种欺骗性形似疲惫的懒惰行为，大量科学家在实验室或医务人员在临床与它进行长期斗争的实践一再证明，我们与它斗争的手段还没有提高到一个高水平上来。
易发生耐药性
结核分枝杆菌
致病性
致病物质
与荚膜、脂质和蛋白质有关。
1.荚膜 荚膜的主要成分为多糖，部分脂质和蛋白质。其对结核分枝杆菌的作用有：
①荚膜能与吞噬细胞表面的补体受体3（CR3）结合，有助于结核分枝杆菌在宿主细胞上的粘附与入侵；
②荚膜中有多种酶可降解宿主组织中的大分子物质，供入侵的结核分枝杆菌繁殖所需的营养；
③荚膜能防止宿主的有害物质进入结核分枝杆菌，甚至如小分子NaOH也不易进入。故结核标本用4% NaOH消化时，一般细菌很快杀死，但结核分枝杆菌可耐受数十分钟。结核分枝杆菌入侵后荚膜还可抑制吞噬体与溶酶体的融合。
2．脂质 据实验研究细菌毒力可能与其所含复杂的脂质成分有关，特别是糖脂更为重要。
结核分枝杆菌
③硫酸脑苷脂（sulfatide）：可抑制吞噬细胞中吞噬体与溶酶体的结合，使结核分枝杆菌能在吞噬细胞中长期存活。
所致疾病
结核分枝杆菌
⑴原发感染：多发生于儿童。肺泡中有大量巨噬细胞，少数活的结核分枝杆菌进入肺泡即被巨噬细胞吞噬。由于该菌有大量脂质，可抵抗溶菌酶而继续繁殖，使巨噬细胞遭受破坏，释放出的大量菌在肺泡内引起炎症，称为原发灶。初次感染的机体因缺乏特异性免疫，结核分枝杆菌常经淋巴管到达肺门淋巴结，引起肺门淋巴结肿大，称原发综合征。此时，可有少量结核分枝杆菌进入血液，向全身扩散，但不一定有明显症状（称隐性菌血症）；与此同时灶内巨噬细胞将特异性抗原递呈给周围淋巴细胞。感染3～6周，机体产生特异性细胞免疫，同时也出现超敏反应。病灶中结核分枝杆菌细胞壁磷脂，一方面刺激巨噬细胞转化为上皮样细胞，后者相互融合或经核分裂形成多核巨细胞（即朗罕巨细胞），另一方面抑制蛋白酶对组织的溶解，使病灶组织溶解不完全，产生干酪样坏死，周围包着上皮样细胞，外有淋巴细胞、巨噬细胞和成纤维细胞，形成结核结节（即结核肉芽肿）是结核的典型病理特征。感染后约5% 可发展为活动性肺结核，其中少数患者因免疫低下，可经血和淋巴系统，播散至骨、关节、肾、脑膜及其他部位引起相应的结核病。90% 以上的原发感染形成纤维化或钙化，不治而愈，但病灶内常仍有一定量的结核分枝杆菌长期潜伏，不但能刺激机体产生免疫也可成为日后内源性感染的渊源。
⑵原发后感染：病灶亦以肺部为多见。病菌可以是外来的（外源性感染）或原来潜伏在病灶内（内源性感染）。由于机体已有特异性细胞免疫，因此原发后感染的特点是病灶多局限，一般不累及邻近的淋巴结，被纤维素包围的干酪样坏死灶可钙化而痊愈。若干酪样结节破溃，排入邻近支气管，则可形成空洞并释放大量结核分枝杆菌至痰中。
1990国外报道各种类型肺结核，40%痰标本检出L型。近年来有人注意到病灶中见有形态不典型的抗酸菌却未见典型结核结节，称之为“无反应性结核”。用结核分枝杆菌L型感染实验动物，也见有同样情况。这是由于结核分枝杆菌L型缺少细胞壁脂质成分，不能刺激结节形成，而仅有淋巴结肿大和干酪样坏死。单从病理变化判断，常被误认为慢性淋巴结炎。有人对155例曾诊断为慢性淋巴结炎蜡块标本作回顾性研究，用卡介苗抗体作免疫酶染色，68.9% 阳性，抗酸染色60%为抗酸颗粒。说明病例中很大一部分与结核分枝杆菌L型有关。临床上对此应予注意，以防漏诊与误诊。
2.肺外感染 部分患者结核分枝杆菌可进入血液循环引起肺内、外播散，如脑、肾结核，痰菌被嚥入消化道也可引起肠结核、结核性腹膜炎等。国外有报道332例血标本仅2例培养出结核分枝杆菌，但将此标本注入豚鼠皮下 12% 感染结核。说明结核分枝杆菌在血中播散的大多不是一般细菌型，而是一种不易生长的L型。近年有不少肺外结核的新报道，结核分枝杆菌的检出率L型多于细菌型：如儿童结核性脑膜炎10例脑脊液培养，9例培养出L型，细菌型仅1例。老年性前列腺肥大排尿困难，术后病理切片抗酸菌L型占61.2%，无1例为典型抗酸杆菌。慢性前列腺炎常规培养阴性者，近1/3检出抗酸菌L型。不育症男子精液检查单见抗酸杆菌7%，单见抗酸L型14%，电镜检查见L型吸附于精子头、尾。以结核分枝杆菌L型感染小鼠，73% 睾丸间质炎症中见有抗酸菌L型。
免疫性
免疫机制
结核分枝杆菌是胞内感染菌，其免疫主要是以T细胞为主的细胞免疫。T细胞不能直接和胞内菌作用，必须先与感染细胞反应，导致细胞崩溃，释放出结核分枝杆菌。机体对结核分枝杆菌虽能产生抗体，但抗体只能与释出的细菌接触起辅助作用。结核分枝杆菌侵入呼吸道后，由于肺泡中80%～90% 是巨噬细胞，10% 是淋巴细胞（T细胞占多数）；原肺泡中未活化的巨噬细胞抗菌活性弱，不能防止所吞噬的结核分枝杆菌生长，反可将结核分枝杆菌带到他处。但可递呈抗原，使周围T淋巴细胞致敏。致敏淋巴细胞可产生多种淋巴因子，如IL-2、IL-6、INF- γ，他们与TNF-α的共同作用可杀死病灶中的结核分枝杆菌。淋巴因子中INF-γ是主要的，有多种细胞能产生INF- γ，浸润的先后为NK、γ /δT和CD4+、CD8+α/βT细胞。上述细胞有的可直接杀伤靶细胞，有的产生淋巴因子激活巨噬细胞，使吞噬作用加强引起呼吸爆发，导致活性氧中介物和活性氮中介物的产生而将病菌杀死。机体内的T细胞根据抗原受体（TCR）的不同可分2种：一种由α链与β链组成，称α/βT细胞（含CD4或CD8标志），另一种由? 链和δ链组成，称γ /δT细胞（大多无CD4或CD8标志）。人与小鼠外周血中前者 ?90%，后者<10%。在抗分枝杆菌免疫中这2种T细胞均起到重要作用。在感染早期α/βT细胞尚未升至高峰时，结核分枝杆菌受γ/δT细胞控制。在与结核分枝杆菌接触后 γ /δT细胞即大量增殖。健康人经分枝杆菌提取物刺激7～10d后，外周淋巴细胞中γ /δT细胞可有所增加，其作用与α/βT细胞同样可杀伤结核分枝杆菌。近年来证明小鼠感染牛分枝杆菌后γ /δT细胞迅速汇集到炎症区，增殖的主要是V 9δ2T细胞亚群，但人活动性结核时此亚群有所下降。
近年来注意到γ /δT细胞攻击的主要是分枝杆菌中的一种热休克蛋白（heat shock protein，HSP）。HSP是一种具有高度保守性的蛋白质，从原核细胞到动植物中均有，其氨基酸顺序有50%同源。在正常生物中含量极少，但在感染、发热、细胞恶变等外界环境条件改变时即大量产生，故HSP又称应激蛋白（stress protein）。HSP在许多病原菌中均有，其氨基酸序列有共同成分，不同细菌引起的亚临床感染均可引起一定程度相同的免疫，被认为是非特异性免疫。
结核的免疫属于感染免疫（infection immunity），又称有菌免疫，即只有当结核分枝杆菌或其组分存在体内时才有免疫力。一旦体内的结核分枝杆菌或其组分全部消失，免疫也随之不存在。
超敏反应
随着机体对结核分枝杆菌产生保护作用的同时，也可以看到有迟发型超敏反应的产生，二者均为T细胞介导的结果。从郭霍现象（Koch phenomenon）可以看到，将结核分枝杆菌初次注入健康豚鼠皮下，10～14d后局部溃烂不愈，附近淋巴结肿大，细菌扩散至全身，表现为原发感染的特点。若以结核分枝杆菌对以前曾感染过结核的豚鼠进行再感染，则于1～2d内局部迅速产生溃烂，易愈合。附近淋巴结不肿大，细菌亦很少扩散，表现为原发后感染的特点。可见再感染时溃疡浅、易愈合、不扩散，表明机体已有一定免疫力。但再感染时溃疡发生快，说明在产生免疫的同时有超敏反应的参与。近年来研究表明结核分枝杆菌诱导机体产生免疫和超敏反应的物质不同。超敏反应主要由结核菌素蛋白和蜡质D共同引起，而免疫则由结核分枝杆菌核糖体RNA（rRNA）引起。二种不同抗原成分激活不同的T细胞亚群释放出不同的淋巴因子所致。
实验室诊断
1.结核菌素试剂 以往用旧结核菌素（old tuberculin，OT）。系将结核分枝杆菌接种于甘油肉汤培养基，培养4～8周后加热浓缩过滤制成。稀释2 000倍，每0.1ml含5单位。目前都用纯蛋白衍化物（purified protein derivative，PPD）。PPD有二种：人结核分枝杆菌制成的PPD-C和卡介苗制成的BCG-PPD。每0.1ml含5单位。
2.试验方法与意义 常规试验分别取2种PPD 5个单位注射两前臂皮内，48～72h后红肿硬结超过5mm者为阳性，≥15mm为强阳性，对临床诊断有意义。若PPD-C侧红肿大于BCG-PPD侧为感染。反之，BCG-PPD侧大于PPD-C侧，可能系卡介苗接种所致。
阴性反应表明未感染过结核分枝杆菌，但应考虑以下情况：①感染初期，因结核分枝杆菌感染后需4周以上才能出现超敏反应；②老年人；③严重结核患者或正患有其他传染病，如麻疹导致的细胞免疫低下；④获得性细胞免疫低下，如艾滋病或肿瘤等用过免疫抑制剂者。为排除假阴性，国内有的单位加用无菌植物血凝素（PHA）针剂，0.1ml含10μg作皮试。若24h红肿大于PHA皮丘者为细胞免疫正常，若无反应或反应不超过PHA皮丘者为免疫低下。
结核菌γ干扰素释放试验
细胞免疫介导的结核菌γ干扰素释放试验（T-cell interferon gamma release assays，TIGRA，又称IFNGRA或GRA）是近年来采用酶联免疫吸附测定（ELISA）或酶联免疫斑点（ELISPOT）法定量检出受检者全血或外周血单个核细胞对结核分枝杆菌特异性抗原的IFN-γ检测释放反应，用于结核菌潜伏感染的诊断。IFN-γ为Thl细胞分泌的一种细胞因子，不但能够反映机体结核的Thl细胞免疫情况，还与体内结核菌的抗原含量密切相关。被结核分枝杆菌抗原致敏的T细胞在遇到同类抗原时能产生高水平的IFN-γ，因此被用于结核潜伏感染的诊断。
目前美国FDA已批准的基于ELISA的QuantiFERON-TB（GIT-G）和欧洲使用的基于ELISPOT的T-Spot.TB，都是以早期分泌性抗原靶-6（ESAT-6）和培养滤液蛋白-10（CFP-10）为抗原的。其中，QFT-G又出现了一种用试管的改良方法，称为QFT-GIT（QFT-inTube）。ESAT-6和CFP-10都是从短期培养的滤液中分离的低分子量蛋白质，具有良好的免疫原性，而且它们是选自结核分枝杆菌基因组差异区1（region of difference，RD1）基因编码的结核杆菌特异性蛋白。某些TIGRA试验除了上述2种抗原外，还常用TB7.7抗原。TB7.7是结核分枝杆菌基因组差异区13（RDl3）基因编码的结核杆菌特异性抗原。这3种抗原在BCG和绝大部分环境分枝杆菌中都缺失（除外堪萨斯分枝杆菌、海水分枝杆菌和苏加分枝杆菌），因此避免了与卡介苗和大多数非结核分枝杆菌抗原的交叉反应。
TIGRA的敏感性和特异性都强于TsT，特别是在HIV感染者、自身免疫性疾病、老人和幼儿等免疫力低下人群的检测中。全球有约1300万人共同感染了HIV和结核杆菌。感染HIV的LTBI由于免疫缺陷，更容易从潜伏感染发展为活动性肺结核。Jiang等对BCG计划接种区域的100个HIV共感染患者用T-Spot.TB检测，结果显示T-Spot.TB对于有过BCG接种历史的HIV共感染的LTBI检测比TsT更敏感快速，而且特异性高。Balcells等发现，QFT-G比TST在诊断HIV的LTBI时更少受免疫抑制的影响。Stephan等发现，QFT-G和T-Spot.TB在检测HIV患者的LTBI时比TST更敏感。QFT-G和T-Spot.TB的协同性很差，对于不同CD4细胞数量的患者有不同的结果。Aichelburg等发现，QFTGIT可以用于HIV-1感染者的活动性肺结核检测。
肿瘤坏死因子α（TNF-α）是一种促炎细胞因子，在多种自身免疫性疾病中起重要的病理作用。但是，抗TNF-α的治疗会导致潜伏性肺结核转变为活动性肺结核，而自身免疫性疾病患者由于免疫抑制。TST容易产生假阴性。研究显示，QFT-G和T-Spot.TB在免疫介导炎症疾病（IMID）患者中检测LTBI的敏感性和特异性都比TST高。终末期肾病（ESRD）患者感染结核分枝杆菌的几率比健康人高10～25.3倍。Lee等比较了QFT-G、T-Spot.TB和TsT在ESRD患者中LTBI的诊断，结果显示QFT-G和T-Spot.TB的结果较类似，但TsT和QFT-G、T-Spot.TB的实验结果相差较远。T-Spot.TB的检出率比QFT-G高（分别为46.9%和40.0%）。然而，也有研究显示QFT-G由于有许多不确定性结果，因此不能用于类风湿性关节炎LTBI的检测。
Bergamini等应用QFT-G、QFT-GIT和T-Spot.TB技术对496个0-19岁的儿童和青少年LTBI进行检测，结果发现2种QFT检测得出的结果更相似，QFT相对于T-Spot.TB在4岁以下儿童中得到的非确定性结果更多。Chun等研究显示，QFT-GIT比TsT在诊断接种过BCG的儿童中LTBI的特异性更强。
上述研究表明，TIGRA在HIV共感染、自身免疫性疾病和免疫力低下的儿童中，对LTBI的检出率更高。但是，TIGRA存在无法区分活动期和潜伏期结核、需要抽血获取淋巴细胞、要求专业的操作人员和具备相应条件的实验室、样品必须在采集后8h内完成等缺点，现阶段仍未能完全取代TsT。另外，现阶段研究的样本都非常小，也没有诊断LTBI的金标准。因此，对于TIGRA还有待进一步研究。
微生物学检查法
结核病的症状和体征往往不典型，虽可借助X线摄片诊断，但确诊仍有赖于细菌学检查。
标本
标本的选择根据感染部位。可取痰、支气管灌洗液、尿、粪、脑脊液或胸、腹水。其他肺外感染可取血或相应部位分泌液或组织细胞。
直接涂片镜检
标本直接涂片或集菌后涂片，用抗酸染色。若找到抗酸阳性菌即可初步诊断。抗酸染色一般用Ziehl-Neelsen法。为加强染色，可用IK（intensified Kinyoun）法染色。将石炭酸复红染色过夜，用0.5% 盐酸乙醇脱色30s，则包括大多结核分枝杆菌L型也可着色。为提高镜检敏感性，也可用金胺染色，在荧光显微镜下结核分枝杆菌呈显金黄色荧光。
浓缩集菌
先集菌后检查，可提高检出率。培养与动物试验也必须经集菌过程以除去杂菌。脑脊液和胸、腹水无杂菌，可直接离心沉淀集菌。痰、支气管灌洗液、尿、粪等污染标本需经4% NaOH（痰和碱的比例为1:4，尿、支气管灌洗液和碱的比例为1:1）处理15min，时间过长易使结核分枝杆菌L型与非结核分枝杆菌死亡。尿标本先加5% 鞣酸、5% 乙酸各0.5ml于锥形量筒内静置，取沉淀物处理。处理后的材料再离心沉淀。取沉淀物作涂片染色镜检。若需进一步作培养或动物接种，应先用酸中和后再离心沉淀。
分离培养
将经中和集菌材料接种于固体培养基，器皿口加橡皮塞于37℃培养，每周观察1次。结核分枝杆菌生长缓慢，一般需2～4周长成肉眼可见的落菌。液体培养可将集菌材料滴加于含血清的培养液，则可于1～2周在管底见有颗粒生长。取沉淀物作涂片，能快速获得结果，并可进一步作生化、药敏等测定和区分结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌。国内学者已证明结核分枝杆菌L型可存在于血细胞内或粘附于细胞表面。这种患者往往血沉加快，用低渗盐水溶血后立即接种高渗结核分枝杆菌L型培养基能提高培养阳性率。
动物试验
快速诊断
一般涂片检查菌数需5x10/ml，培养需1x10/ml，标本中菌数少于此数时不易获得阳性结果，且培养需时较长。目前已将多聚酶链反应（PCR）扩增技术应用于结核分枝杆菌DNA鉴定，每ml中只需含几个细菌即可获得阳性，且1-2d得出结果。操作中需注意实验器材的污染问题，以免出现假阳性。又细菌L型由于缺壁并有代偿性细胞膜增厚，而一般常用的溶菌酶不能使细胞膜破裂释出DNA，以致造成PCR假阴性。用组织磨碎器充分研磨使细胞破裂后，则可出现阳性。目前有条件的单位使用BACTEC法，以含14C棕榈酸作碳源底物的7H12培养基，测量在细菌代谢过程中所产生的14C量推算出标本中是否有抗酸杆菌，5～7d就可出报告。
近年来国内外研究证明临床各种类型的肺结核患者中40% 左右分离出L型。经治疗的结核病人细菌型消失，L型常持续存在。有空洞患者痰中已不排细菌型者，8% 左右仍可检出L型。故有学者建议将多次检出L型亦作为结核病活动判断标准之一，细菌型与L型 均转阴才能作为痰阴性。
防治原则
预防
近20年国际组织提出控制结核病主要方法有：①发现和治疗痰菌阳性者；②新生儿接种卡介苗。约 80% 获得保护力。1940年代中国部分城市调查肺结核病死率200/10万以上。解放后卫生条件改善，1973～1977显示病死率已下降至30/10万。但1979年以来全国三次大规模抽样检查疫情下降很慢。1979～1990每年患病率递降率2.8%，痰阳性递降率为3.0%。目前死亡率19/10万，仍为其他传染病之和的2倍。卫生部要求2000年新生儿卡介苗接种率达90%。据统计新生儿时接种过的人以后的发病率比未接种过的减少约80%。
卡介苗是活疫苗，苗内活菌数直接影响免疫效果，故目前已有冻干疫苗供应。新的核糖体RNA（rRNA）疫苗已引起关注，但尚处在试验阶段。
治疗
利福平、异烟肼、乙胺丁醇、链霉素为第一线药物。利福平与异烟肼合用可以减少耐药性的产生。对严重感染，可以吡嗪酰胺与利福平及异烟肼合用。1g干酪灶或空洞约含结核分枝杆菌106～10。每105～6菌可有1种耐药突变产生，对2种耐药需菌1011，故以2药联合应用为宜。
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