细胞融合/激活
4.1 融合与激活
核移植
由于微吸管破坏了卵膜和一部分细胞质,若直接移植,成功率很低,故需对重组胚融合,其采用的方法有仙台病毒法、物理或化学方法(如电融合法、钙离子载体、乙醇、蛋白质酶合成抑制剂等)激活受体细胞,使其完成细胞分裂和发育过程,电融合法更常用。电融合时选择的电压范围和脉冲频率取决于融合箱中两个电极的距离。融合箱的距离由200μm,到几毫米,因此在脉冲是200μsec倍数且能传导lKV/cm的直流电基本满足要求。对小鼠、家兔等实验动物进行胚胎核移植时还发现,受体卵母细胞在重构胚电融合时被激活的状态与重购胚的发育率密切相关,脉冲强度为2.0-3.6K/cm、融合时间为60-200μsec是适宜范围。若脉冲过强,融合时间过长,对重构胚的进一步发育极为不利。Kono等提出针对不同时期的供体核采取不同激活程序得到了较好的实验结果:①对于G2期和M期的供体核即4倍DNA供体,在融合时可采用不引起卵母细胞活化的仙台病毒或细胞质内注射,然后再给予激活处理,使一半DNA以极体方式排出,随后形成原核及正常2倍体细胞,应用此法已产生了正常的小鼠;②对于G0、G1及S期供体核,可采用融合前激活和融合时激活两种方式,以防止供体核形成中期板而导致染色体的不正常。Szollosi用小鼠胸腺细胞作核移植实验时发现,只有成熟的去核卵母细胞被激活前或激活后30min进行融合,移入的供体细胞核才发生降解,并重新聚合形成新核膜,若超过30min再触合,虽然移入的供体核才发生降解,这可能会使供体染色质与受体细胞质诸因子的有效互作受到抑制,从而使再程序化过程受阻。Wakayama等人利用受体卵母细胞化学激活和重构胚化学融合的方法,也在小鼠体细胞克隆和再克隆的研究中取得了理想的结果。对兔卵电融合完成后,卵母细胞也因电刺激受到激活从而开始新的编程和发育,但对小鼠、大鼠和牛等还需进一步充分的激活才能获得发育。其方法有化学和电激活两种,化学激剂有7%乙醇、Ionomycin(离子霉素)、钙离子载体A23187,采用Ionomycin激活后再用6-DMAP处理3h,可避免出现PCC(早熟染色体凝集),并增加羊重构胚的发育率及出生率。 4.2 融合率与细胞期
Prather等(1989)研究结果表明,融合率与细胞期无显着差异,说明卵裂球体积变小对融合率并无显着的影响,张涌(1992)在小鼠研究中也得出类似的结果。Robal等也认为,融合率与受体卵母细胞的时龄有关,并且还与核供体接触的面积和接触的紧密程度有关,而与移入的卵裂球处于什么时期无关,但是重构胚的发育率与供体胚的细胞期是有关的。 4.3 温度、卵母细胞成熟时间对卵母细胞激活的影响
随着卵母细胞在体外成熟时间的延长,进而老化,成熟促进因子(MPF)下降,易激活。体外成熟老化的牛卵母细胞对温度诱导激活高度繁感,在一定的温度诱导激活下,卵母细胞染色质聚缩,"自动去核"的频率高。幼稚卵母细胞不容易在室温下激活,即使激活也不稳定,可能逆转到中期。