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基本信息
| 外文名 | inclusion body |
| 别名 | 水不溶性的结构称为包涵体 |
| 适用领域 | 重组蛋白的表达过程 |
| 范畴 | 生物学 |
正文
形成
在基因重组技术得到迅速发展之前，研究者就已经发现，细胞内人工引入反常的蛋白质（这些蛋白质可以看作是细胞的外源蛋白质），这些蛋白质会堆积起来形成不溶的形式。这些蛋白质聚集的形态是明显的球形，这些球形的物质全部是蛋白质，并且通过非共价键的作用力形成，必须使用变性剂如十二烷基硫酸钠（SDS）或者盐酸胍才能溶解。自从基因工程的蛋白质在大肠杆菌表达以后，
人们逐渐发现这些外源蛋白质基因在细胞中的过量表达同样形成不溶性的状态。
Georgiou等人发现天然的蛋白质在大肠杆菌中大量表达时，如内酰氨酶和碱性磷酸酶的过量表达，都形成了包涵体，前者的包涵体在外周质，后者的包涵体存在于细胞质中。其它的宿主细胞中也发现了重组蛋白质过量表达时形成的包涵体或者聚集体，如细菌病毒、哺乳动物细胞中。
包涵体在一些外界压力下也可以形成，如温度，是影响包涵体形成与否的主要因素。有些蛋白质在高温的情况下容易形成包涵体，这是由于这些蛋白质在高温下容易变性而形成聚集体。所以有人认为，当蛋白质具有高的融化温度、高的天然构象稳定性的情况下，包涵体就不容易形成。但是，对一些体内包涵体形成的研究发现，包涵体的形成先于成熟肽链的形成，或者是同时进行的。在研究P22尾刺蛋白质发现，尽管尾刺蛋白质有高的稳定性，结构中主要是片断，融化的温度是88℃，并不受SDS、蛋白质酶和热失活的作用，但是这种蛋白质是为数不多的在细胞内形成包涵体的原核蛋白质模型。有些天然的蛋白质在高温（391℃）表达时可以提高25%，但是这些蛋白质不能折叠成天然的状态而形成聚集体。聚集体形成的动力学表明，这些聚集体是从部分折叠的中间体形成的。实际上，这些折叠的中间体或者形成天然的状态，或者形成聚集体，这个过程是温度依赖性的，温度的升高利于聚集体的形成。当蛋白质肽链在高温下表达，合成的肽链足够早地转移到低温下时，这些蛋白质肽链会重新进入折叠的过程。同时，当尾刺蛋白质在允许的温度下表达后，再把细胞转移到高温下，这些蛋白质肽链保持活性，证明了一旦蛋白质被正确的表达并折叠成正确的构象以后，则细胞内的蛋白质的稳定性和溶解性在高温下不再改变。蛋白质在体内折叠的中间体对于温度因子明显敏感。
其它的发酵条件同样影响蛋白质包涵体的形成，发酵液中加入蔗糖可以大大降低内酰胺酶包涵体的形成。蔗糖的作用可能是稳定天然蛋白质的结构或者防止蛋白质折叠中间体的聚集。在体外的内酰胺酶折叠复性的过程中，同样发现复性缓冲液中加入蔗糖可以提高蛋白质的复性率。其它促重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂还有乙醇（诱导热休克蛋白质的表达）、低分子量的巯基或二硫化合物（影响细胞周质的还原态，从而影响二硫键的形成）和NaCl。也有报道认为在丰富的培养基中有利于活性蛋白质的表达，当培养条件不佳时如供氧不足或pH控制不佳时易形成包涵体。
蛋白质的聚集体和包涵体不仅仅存在于重组蛋白质的表达中，是一个广泛存在的现象。通常认为，蛋白质的聚集现象，无论细胞内还是细胞外，都是中间体不能完成折叠而形成自我聚集现象。包涵体的形成与多肽链的序列、表达速度、可用的伴侣分子的量以及生长的环境有关。
特点
包涵体
Zetlmeissl等人利用圆二色的方法，发现聚集体的肽链保持了部分的二级结构。利用Raman测定的方法也得出了相同的结论。利用ATR-FTIR发现包涵体蛋白质的结构比天然的蛋白质和盐沉淀的蛋白质含有更多的非天然状态的折叠的结构。Murry等人利用免疫学的方法测定色氨酸合成酶的亚基，蛋白质复性以后，出现三种形式的蛋白质：一种是不溶的高分子量的聚集体，一种是可溶的复性完全的蛋白质，一种是可溶的低分子量的聚集体，最后一种聚集体同天然的蛋白质一样有免疫活性，可以与两种单克隆抗体结合，但是天然蛋白质的另外三种抗体不与它结合，说明了即使没有复性，聚集体仍保持了部分的近似天然的结构状态。
在大肠杆菌中，包涵体可以在细胞的两个位置出现：细胞质和外周胞质。包涵体在细胞内形成的位置和特点取决于蛋白质表达的方式。三种表达的内酰氨酶，一种是天然的内酰氨酶，一种是含有OmpA信号肽，一种完全切除了天然蛋白质的信号肤，当大量表达时，造成了聚集体的形成，前两者的聚集体在外周胞质，后者在细胞质内形成聚集。这些包涵体在大小和形状有相当清楚的差别，这些差别表现了聚集体的表面形态、组成和形成聚集体的多肽链构象上的不同。
大肠杆菌细胞质中的包涵体直径一般在0.2到1.5μm之间，不同的蛋白质具有不同的直径，如干扰素的大小是0.811μm，而牛凝乳酶原的大小是1.281μm。大的包涵体可以利用光学显微镜看得到。在一些情况下，有些包涵体比较大，直径大于大肠杆菌的直径，使得大肠杆菌有一个突起。一般情况下，一个细胞仅有一个包涵体。包涵体从来不吸附在膜上，并且不同于真核细胞中的其它的细胞器。高精度的投射电子显微镜显示了多孔的结构。
包涵体
聚集体的构象还没有进行系统的研究，但是已经知道聚集在一起的作用力不是共价键，主要的是疏水相互作用力。大肠杆菌的细胞质中有大量的谷胱甘肽，抑制二硫键的形成。所以，当蛋白质在细胞质中表达时，由于形成不了二硫键而形成了聚集体。内酰氨酶的包涵体进行蔗糖梯度离心表明其中95%是蛋白质成分，说明很少有其他的蛋白质成分加入到聚集体中，利用免疫学的方法，也没有发现伴侣分子。体内聚集体的形成不仅产生包涵体，而且会带来淀粉质的疾病，对哺乳动物同样会造成疾病。
对体内或者体外蛋白质聚集体形成的研究，特别是了解氨基酸序列如何避免聚集体的形成，可以大大提高蛋白质在体外折叠的收率，并且有助于理解体内分子病形成的机制。
病毒包涵体
包涵体有的位于细胞质中（如天花病毒包涵体），有的位于细胞核中（如疱疹病毒），或细胞质、细胞核中都有（如麻疹病毒）。
有的包涵体还具有特殊名称，如天花病毒包涵体叫顾氏（Guarnieri）小体，狂犬病毒包涵体叫内基氏（Vegri）小体。昆虫病毒可根据包涵体的形状、位置而分为细胞质型多角体病毒、核型多角及颗粒体病毒等。
分离
一旦一个稳定的、重复的发酵过程建立起来，则要考虑提取包涵体的步骤了。包涵体处在细胞质内或者细胞的外周质，必须破坏细胞膜才能把包涵体释放出来。
包涵体
提取的第一步是冷却发酵液，利用离心或者错流过滤的方法收集细胞，细胞的沉淀利用设定的含有一定浓度的离子强度（0.4-0.6mo1）的缓冲液悬浮。这种缓冲液必须控制pH、离子强度、重金属的浓度和氧化还原的环境，在以后的操作步骤中也要考虑这些因素。
由于包涵体比细胞可以耐受更大的剪切力，所以可以使用的破碎细胞的方法有很多。对于大肠杆菌，最经常使用的方法是高压匀浆的方法，可以使细胞完全破碎，并且这种方法可以以不同的规模使用，2到5个循环可以使细胞完全破碎。酵母细胞由于含有更加有弹力的细胞壁，所以需要的循环可能更多，或者在容器中加入一些玻璃颗粒。破碎细胞还可以使用物理的方法如超声，或者化学的方法如化学试剂和酶，如溶菌酶和EDTA（乙二胺四乙酸）来破碎细胞。
包涵体可以使用过滤或者离心的方法，把细胞破碎液中的其它成分除去，这两种方法利用了包涵体的不同物理特性。由于包涵体和可溶蛋白质的体积不同，所以可以使用过滤的方法，这种方法可以降低操作成本，易于放大。一些实验已经证明过滤的方法是分离包涵体的有效的手段，但是这种方法也存在着一些缺点：过滤膜很容易被一些不透过的成分所堵塞，即使使用错流过滤或者使用很高的流速，这种情况都不能避免。并且，由于微孔膜是根据成分的大小来分离的，一些细胞碎片也容易与包涵体混在一起。
而包涵体蛋白质的密度比相同体积的细胞碎片的密度大得多，所以使用离心的手段可以把包涵体与细胞的其它成分分离开来。如果细胞碎片没有同包涵体分离，在以后的分离手段中必须把膜上的组分分离开来。有时，有些目标蛋白质以溶解的形式存在，可以通过在细胞破碎以前加入一些非极性的物质（如苯酚、甲苯）或者去垢剂，通过这个方法可以提高从大肠杆菌表达的人生长激素包涵体的收率。
连续离心技术是工业生产中获得包涵体最经常使用的操作。由于细胞碎片的密度比包涵体小，则沉降的速度比包涵体要小，连续的悬浮、离心可以把大部分的包涵体离心下来，而细胞碎片逐步除去。SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酞胺凝胶电泳）分析发现，离心的方法可以达到沉降物中的蛋白质的含量大于90%。
包涵体
离心和高压匀浆都有可能产生泡沫，所以必须在工业规模中避免这种无谓的损失。有些工业生产中，分离以前在发酵罐中把细胞杀死使细胞内的物质释放出来，并同时溶解或者不溶解包涵体蛋白质。这种在线杀死细胞的方法己经用来生产两种蛋白质：在碱性条件下溶解类胰岛素生长因子和高温、酸性条件下生产重组的抗真菌肽段。这种方法的优点是可以节省操作时间以及能量消耗，仅仅需要一步离心的步骤。最经常使用的杀死细胞的试剂有苯乙醇，辛酸，氯仿，甲苯等。杀死细胞时也有缺点，溶解的目标蛋白质中含有蛋白质或者非蛋白质的物质，降低了蛋白质的纯度；如果目标蛋白质没有被溶解，则杀死细胞会使可溶蛋白质产生沉淀，使得包涵体的纯化比较困难，或者破坏包涵体内部的重组蛋白质。
溶解
维持包涵体内蛋白质结构的作用力是分子内的作用力，这种作用力也维持天然蛋白质的稳定性的结构。先前有报道这种作用力是共价键结合的，但是，现在趋向于一致，就是维持包涵体内部的蛋白质的紧密的结构的是非共价键的作用力。二硫键，无论是正确的还是错误的二硫键，在维持内部蛋白质的紧密的结构中都没有发挥直接的作用。最经常的获得活性蛋白质的第一步是溶解这些包涵体蛋白质，溶解液是使这些包涵体蛋白质完全变性的成分，当蛋白质被溶解以后，则进入到蛋白质的体外折叠的过程。
包涵体
包涵体蛋白质的溶解同样是一个工艺的关键的步骤。溶剂的选择会影响后续的操作、最终的各种蛋白质的收率以及最终的成本，必须遵循以下的标准：
(1)快速溶解的动力学；
(2)与蛋白质的结合是可逆的；
(4)对温度没有依赖作用；
(5)抑制蛋白质酶的降解作用；
(6)与蛋白质的氨基没有化学修饰作用；
(7)在可能的情况下，选择最低的溶解浓度和廉价的溶剂，并适于以后的复性方法。
2. 溶解包涵体的试剂
最经常使用溶解包涵体的试剂包括离液剂或者去垢剂。
最经常使用的溶解和制备蛋白质的离子型的离液剂最早于1969年Hatefi等人发展的离子型的去垢剂如SDS是另外一种溶解包涵体蛋白质和膜蛋白质的试剂，但是一般不用来大规模的生产，而是用来定性。除了强酸、强碱和利用有机溶剂来提取疏水性很强的蛋白质以外，其他的变性方法如非可逆的共价修饰在工业的大规模生产中很少用到。一旦蛋白质被溶解，蛋白质中的巯基很容易快速地氧化并形成共价的聚集体或者分子内错配的二硫键，然后这些蛋白质就不能再进行折叠。为了防止氧化，可以使这些基团或者利用缓冲液中含有低分子量的疏基试剂保持在还原的状态或形成磺酸盐或者形成混合的二硫键。
包涵体
去垢剂是一种最经济的溶解包涵体蛋白质的方法，一个最大的优点是溶解的蛋白质有可能保持全部的生物活性，说明在此条件下保持了蛋白质的四级结构。最重要的是稀释以后蛋白质的聚集比其它溶剂生成的很少。阳离子型、阴离子型的和非离子型的去垢剂都可以使用，使用时的浓度一般高于去垢剂的临界胶束浓度（CMC ），通常是0.5-5%。
SDS仅仅在大量生产牛生长激素、干扰素和白介素-2中用到。SDS由于具有较低的临界胶束浓度（CMC）而使得结合到蛋白质分子上的SDS比较难于除去。由于N-十二烷肌氨酸它的CMC比SDS高0.4%，也被用来溶解包涵体蛋白质并可用稀释的方法使蛋白质复性，残余的去垢剂可以使用阴离子交换色谱或者超滤的方法除去。这种去垢剂是一种比较温和的去垢剂，可以选择性地溶解一些包涵体，但是不能溶解完全的变性的蛋白质的聚集体和大肠杆菌的内膜的蛋白质分子。使用去垢剂一个主要的缺点是对以后的纯化和复性的步骤的干扰，去垢剂结合到蛋白质上的强度大离子交换色谱复性蛋白质小不同，比较难于除去，并干扰离子交换和疏水相互作用色谱的过程，在变性的浓度时超滤膜会吸附这些变性剂。所以复性后需要尽量洗涤这些去垢剂，也可以使用环状糊精链状糊精或者环状淀粉从复性缓冲液中提取去垢剂。
a)先期使用可以溶解膜蛋白质但是不溶解包涵体蛋白质的溶剂尽量洗涤包涵体蛋白质；
b)包涵体的含有的菌体碎片被完全除去；
c)溶解包涵体的液体中含有蛋白质酶的抑制剂，如EDTA，苯甲基磺酰氟（PMSF ）等。
（2）离液剂
在溶解色氨酸合成酶A的过程，发现阳离子的溶解能力顺序是Gdm+ > Li+ > K+ > Na+，阴离子的顺序是SCN- > I- > Br- >Cr-。一些离液剂由于它们的溶液比盐酸胍和尿素有更高的密度和黏度而不适合用于溶解包涵体，因为利用离心和色谱分离起来比较困难。
为了溶解包涵体蛋白质需要的尿素或者盐酸胍的浓度根据蛋白质的不同而不同。如果蛋白质天然形态需要溶解的变性剂的浓度不能获得，则在溶解包涵体时需要首先确定离液剂的浓度。
包涵体
（3）混合溶剂
一般情况下去垢剂并不联合使用，Lilly等人发现去垢剂和尿素的混合液有效的摩尔浓度较低。尿素和去垢剂型的盐混合可以使蛋白质变性，但是尿素和非去垢剂的盐如氯化钠反而降低包涵体蛋白质的溶解性，所以要避免使用。
高压（1-2kbar）、超声也可以溶解包涵体蛋白质，此时使用的溶解试剂浓度可以比较低，便于后续的复性步骤。
3. 极端pH
包涵体
高pH（≥12）也被用来溶解生长激素和原胰岛素。在高pH下一些蛋白质同样可能发生非可逆的变性，原因在于半胱氨酸在碱性条件下的脱硫过程。所以这种方法尽管比较简单、廉价，同样仅仅用于一些特定的蛋白质，特别对于药用蛋白质一般不采用这种方法。
包涵体与蛋白质
1. 真核细胞表达外源蛋白质的缺点
包涵体
（1）真核细胞的天然蛋白质的表达和外源蛋白质的表达，表达量相当少，即使有的蛋白质表达量高时，容易出现蛋白质的无活性的现象，或者形成聚集体；而原核细胞表达的蛋白质量比真核细胞大很多；
（2）相对于大肠杆菌，人类对于真核细胞的基因的了解还是有限的，而对大肠杆菌的基因了解的相当透彻，并能进行熟练的基因重组等操作对大肠杆菌的基因进行改造；
（3）真核细胞生长到高密度需要更长的时间（7天左右），并且细胞的最终浓度低，所以需要较大的培养容器，而大肠杆菌可以在几个h以内达到108cells/mL；
（4）动物细胞生长的培养液的造价较高，并且大部分使用血清作为生长液的添加剂，从而提高了产品的造价并且不利于以后的纯化步骤；
包涵体
基于以上的原因，真核细胞尤其是哺乳动物细胞表达外源蛋白质大部分处在研究阶段，大部分重组蛋白质使用的表达载体是大肠杆菌细胞。大肠杆菌表达的外源蛋白质量相当大，有时达到细胞内蛋白质总量的5-20%，甚至达到50%以上。但是，大肠杆菌表达的蛋白质，当含量相当大时，有时由于原核细胞缺少分泌到胞外的机制或者折叠的机制，最后表达的蛋白质往往以无活性的包涵体的形式存在。
2. 包涵体表达蛋白质的优越性
为了研究基因的功能，可以把体内的基因转移到其他表达宿主中，研究基因表达性状以确定基因的功能。但是，外源基因的表达，特别是真核生物基因在大肠杆菌中的表达，由于宿主菌缺乏此种基因表达的调控机制，细胞内的化学环境与其天然环境差异，如氧化还原环境、胞内pH、自由水的浓度，以及外源基因的导入，使得表达目的蛋白质的细胞在非正常状态下生长，表达的蛋白质多数以无活性的包涵体的形式存在。
在下游生产过程中特别是在医药生产中，以包涵体形式表达的蛋白质具有一些优越性。
（1）异源表达的蛋白质很容易被宿主细胞内的蛋白质酶降解，如果重组蛋白质以包涵体形式表达，由于包埋了酶攻击的位点，可以最大限度地抵抗蛋白质酶的攻击；
（2）包涵体表达的蛋白质没有活性，细胞破碎和以后的纯化步骤不用考虑蛋白质的失活问题；
（3）包涵体形式表达的蛋白质与宿主细胞的其他蛋白质的分离比可溶蛋白质的分离方法简便，造价低，使用简单的离心或者过滤的手段就能使包涵体与宿主细胞的其他蛋白质成分进行有效的分离；
（4）有些表达的外源蛋白质对细胞有毒性或者致死，大量表达时会导致细胞的死亡，最终的细胞数量和产物相当低；而包涵体形式的蛋白质由于丧失了生物活性从而可以高效大量地表达；
（5）对于以包涵体形式表达的产物可以比较容易进行在线观测定性，含有包涵体蛋白质的细胞有较大的折射率，不必像可溶的蛋白质需要细胞破碎后使用酶学或者电泳学的方法进行鉴定。
包涵体
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